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Méthode pour la propagation de semis d'orchidée

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Dans la nature, ce sont les insectes ou les colibris qui assurent la pollinisation lorsqu'ils viennent se nourrir du nectar des fleurs. Lorsque la pollinisation est réussie ; la fleur fane et l'ovaire se développe en renfermant les graines. Celles-ci parviennent à maturité au bout de trois à neuf mois.

Les graines très fines ne possèdent pas de tissus de réserves. Lors de leur germination dans la nature, elles sont « aidées » par une association symbiotique avec un champignon microscopique appelé mycorhize, qui fournit à la graine les éléments nutritifs dont elle a besoin pour sa croissance. En laboratoire, le sélectionneur remplace les mycorhizes par la culture sur un milieu nutritif spécial, essentiellement composé d'eau, de sels minéraux et de sucres.
Le substrat utilisé doit être stérile pour éviter tout risque de contamination par des champignons ou des bactéries pathogènes.
Les graines germent donc au bout de trois à neuf mois.
Sous conditions stériles toujours, elles sont transférées sur un autre milieu nutritif qui favorise la croissance des pousses et des racines.

En deux ans environ, les plantules se développent dans des petites boites closes sous lumière artificielle.
Elles sont ensuite assez robustes pour quitter leur milieu stérile et poursuivre leur croissance sous serre.
Plus les plantules sont développées, mieux elles supportent cette transplantation.
Elles doivent être capables de puiser les éléments nutritifs dont elles ont besoin et de résister aux germes de maladies.

A - Préparation du matériel :


1 - Méthode pour la fonte du milieu :

La culture in vitro (aussi appelé micro propagation) est une technique visant à régénérer une plante entière à partir de cellules ou de tissus végétaux en milieu nutritif, en utilisant des techniques modernes de culture cellulaires.
Elle permet de garder des plants stériles, exempts de virus et autres infections en plus de pouvoir produire rapidement une large quantité de plantules. Elle est utilisée pour la création de nouvelles plantes (par exemple des plants génétiquement modifié) ; la multiplication de plantes commerciales produisant peu ou pas de graines ; ou encore la conservation et multiplication d’espèces rares.
Typiquement, les plantes (seule une ou quelques cellules suffisent) sont placées sur un milieu de croissance stérile (qui comprend du saccharose comme source d’énergie, des vitamines et des nutriments) et dans un environnement avec une température, un taux d'humidité et une luminosité contrôlés. La multiplication végétative est un processus spécifique des plantes. Chaque cellule possède en effet, les potentialités nécessaires et suffisantes pour se multiplier et cela est surtout pour s'organiser en tissus différentes permettant de reconstruire une plante avec son ADN. La découverte des hormones végétales a permi la multiplication en conditions aseptiques, c’est-à-dire in vitro, des plantes. Sa complète maîtrise est encore loin d'être atteinte dans la majorité des cas.

Trois méthodes de multiplication in vitro peuvent être envisagées :

> la culture de méristèmes ou d'apex de tige : chez les embryophytes (plantes vertes), un méristème est un tissu biologique constitué de cellules indifférenciées (ou peu différenciées) formant une zone de croissance où ont lieu les divisions cellulaires (mitoses). On distingue habituellement les méristèmes primaires, qui assurent la croissance de la plante en longueur, au niveau de la tige, des feuilles ou des racines, et les méristèmes secondaires, responsables de la croissance en diamètre des organes de certaines plantes, comme le tronc.
Seul tissu végétal capable de créer de nouvelles cellules, le méristème est essentiel au développement des végétaux. Il crée ainsi toute la plante : il est à l'origine de la tige, des feuilles, des racines, des fleurs (chez les plantes a fleurs ou encore des branches. Il est en outre responsable de la disposition particulière des feuilles ou des branches autour de la tige, ce qu'on appelle la phyllotaxie. Elle demeure la plus généralisable et la plus sûre pour assurer la reproduction de copies conformes. De plus elle peut associer la lutte phytosanitaire à la multiplication.

> la reconstitution de plantes par néoformation de bourgeons et de racines sur un cal [c'est une structure de prolifération cellulaire obtenue notamment en culture in vitro par l'ajout d'hormones végétales].

> l'embryogenèse somatique qui permet la régénération de plante à partir de cellules humaines.

On utilise le phénomène de la totipotence végétale en différenciant les cellules d'un ex-plant prélevé sur la plante mère [en biologie, la totipotence est la qualité d’une cellule capable de se différencier en n’importe quelle cellule spécialisée. C'est le cas par exemple des cellules souches embryonnaires et des cellules CFU GEMM. Chez l'homme, l'oeuf fécondé et les cellules filles issues de ses toutes premières divisions sont les seules vraies cellules totipotence. Les cellules végétales ont la particularité d'être généralement totipotence. On dit d'une cellule qu'elle est totipotence si elle peut générer un organisme entier].
L'obtention de cals est intéressante dans la perspective de production de semences artificielles. Pour cela, après une dispersion des cellules, on déclenche l'embryogenèse [c'est le processus de formation d'un organisme pluricellulaire, végétal ou animal, de la cellule oeuf issue de la rencontre des gamètes parentaux à un être vivant autonome] avec un jeu d'hormones végétales sur le cal obtenue. Une fois les embryons bien formés, on les stabilise et on met en place un enrobage nutritif et une protection appropriée.
Les hormones végétales impliquées dans ce phénomène, n'ont été découvertes que dans les années 40. Ainsi, on produit des cals en culture in vitro avec la présence de lait de coco dans le milieu de culture. Ce n'est que trente ans plus tard que l'on y trouve la zéatine [c'est une hormone végétale naturelle isolée à partir du maïs se situant au niveau du phloéme. Sa forme ribosylée, la zéatine riboside, se retrouve principalement dans les racines des plantes. Elle appartient à la famille des cytokinines. Elle a deux stéréoisomeres cis- et trans. La cis-zéatine joue un rôle dans l'arrêt de la dormance de la pomme de terre. C'est la cytokinines la plus répandue dans le règne végétal] et la cytokine [ce sont des substances solubles de communication synthétisées par les cellules du système immunitaire ou par d'autres cellules et/ou tissus, agissant à distance sur d'autres cellules pour en réguler l'activité et la fonction. Le terme cytokine est peu connu du grand public alors qu'avec les hormones et les neuromédiateurs, ces molécules sont essentielles à la communication de nos cellules].
Les cals sont des structures tissulaires qui apparaissent naturellement lors du bouturage de certaines espèces telles Crassula ou Opuntia. Ce sont deux espèces qu'on multiplie très facilement en laissant sécher quelques jours la bouture avant de la placer dans un substrat sableux. Alors se forme un cal.


2 - Préparation de l'hypochlorite

L'hypochlorite de calcium Ca (ClO) 2 est couramment utilisé lors de la stérilisation d'ex-plants végétaux, en vue de la mise en culture in vitro. La solution peut être utilisée à différentes concentrations. Il est aussi utilisé comme désinfectant pour piscine.
Le chlorure de chaux est un mélange d'hypochlorite de calcium et de chlorure de calcium.


B - Les différentes étapes


1 - Matériel pour la préparation :

- préparez d’avance les pots de culture qui auront été bien lavés et séchés (vous pouvez utiliser les petits pots de bébé avec leur couvercle, vous ne pourrez les utiliser qu’une seule fois car les intérieurs des couvercles finissent par rouiller)
- un milieu à fondre type semis (se commande chez les professionnels d’orchidées)
- poudre d’agar-agar
- eau stérile (eau distillée, s’achète sous forme de petits flacons en pharmacie, possibilité d’acheter en cinq litres)


2 - Méthode pour la fonte du milieu :

L'agar-agar (mot d'origine indonésienne malaise, appelé E406 dans la liste des additifs alimentaires) est un produit gélifiant obtenu à partir d'algues rouges appartenant aux familles des Gelidiacées (Gelidium et Pterocladia) et des Gracilariacées(Gracilaria). C'est un polymère de galactose (galactane) contenu dans la paroi cellulaire de certaines espèces d'algues rouges (rhodophycées).
Cet extrait serait riche en fer. L'agar-agar purifié, débarrassé de tous ses éléments minéraux s'appelle l'agarose, utilisable selon son niveau de pureté dans diverses applications de biologie moléculaire.
Par dessiccation [c'est un procédé d'élimination de l'eau à un stade poussé. Il s'agit d'une déshydratation visant à éliminer autant d'eau que possible. Ce phénomène peut être naturel ou forcé], ces algues forment un mucilage [c'est une substance végétale constituée de polysaccharides, qui gonfle au contact de l'eau et produit une substance visqueuse semblable à la gélatine. Cette substance a par conséquent des propriétés épaississantes, adhésives et adoucissantes. Avant l'utilisation de la gélatine et de diverses autres substances, les racines de la guimauve, une plante des zones humides, étaient utilisées pour créer une pâte : la pâte de guimauve. Ses propriétés en font un laxatif] qui par pulvérisation donne l'agar-agar utilisé essentiellement pour gélifier les milieux de culture pour les micro-organismes. Il est appelé kanten au Japon où il est utilisé dans certaines pâtisseries, se présentant alors sous forme de longues barres transparentes ou en poudre. Cette substance s'utilise en très petites quantités. Elle n'a pratiquement ni goût ni couleur. C'est un liant et gélifiant végétal parfait pour remplacer la gélatine animale, il existe une multitude de recettes dans lesquelles l'agar-agar peut être utilisée : confitures, gelées de fruits, flans, etc. La gelée se forme à condition d'être chauffée à 90°C, mais ne "prend" qu'à une température de 40°C environ. L'agar-agar permet de servir des mousses chaudes. L'agar-agar rentre aussi dans la composition d'un aérogel appelé SEAgel qui est similaire à de l'aérogel organique, avec un goût et une consistance rappelant les gâteaux de riz.

Souvent les doses que vous commandez chez les professionnels sont prêtes pour la fonte.
Ces doses sont préparées pour 100 ml d’eau stérile.
Disposez une petite casserole propre sur une bouche de gaz, verser 100 ml d’eau stérile dans cette casserole, vous pouvez utiliser le micro-onde pour faire fondre vos poudres si vous préférez mais vous aurez beaucoup de mal à contrôler pour faire bouillir.
Personnellement je préfère le faire au gaz car quand votre eau commence à bien bouillir, stoppez le feu et versez en premier la poudre d’agar-agar, tournez en même temps avec une fourchette en inox, puis quand la poudre est bien fondue dans votre eau stérile, versez la poudre brune/noire (poudre d’agar-agar +milieu de semis orchidées phytamax P6668 avec la première fonte puis bien remuer jusqu'à parfaite dissolution).
Maintenant votre future gélose est prête pour être versée dans ses pots définitifs.


3 - Matériel pour la cuisson vapeur :

Vous pouvez utiliser un autocuiseur du type Sensor.
Versez 2 L d’eau stérile dans le fond puis replacez le support plus le panier.
Déposez vos petits pots bien fermés dans le panier de l’autocuiseur, essayez de les immobiliser avec des couverts en inox ou un cintre en fil de fer plié et plaqué sur le haut de vos couvercles.


Pendant la « cuisson vapeur » vous pouvez y glisser vos ustensiles : scalpel en acier et autre matériel chirurgical emballé dans de l’aluminium afin de stériliser.
Refermez le couvercle de l’autocuiseur et programmez 30 mn avec la minuterie.
Mettez sur le feu l’autocuiseur et pendant que la température monte, laissez chauffer en laissant la soupape dessus.
Quand elle commence à siffler (ou dans le cas d’une SENSOR que le clapet remonte au niveau de la poignée de verrouillage), lancez le début de votre programmateur.
Pendant une demi heure le tout va monter à haute température, assurez-vous d’avoir un autocuiseur avec un joint en très bon état.
A la fin des 30 mn, fermez le gaz et ne touchez pas à la soupape.
Il faut laisser retomber la pression par un refroidissement naturel, la vapeur d’eau enfermée dans l’autocuiseur doit refroidir seule et lentement (dans le cas d’une SENSOR, le petit clapet de la poignée descend lorsque la vapeur est totalement refroidie).
Ouvrez le couvercle en faisant attention de ne pas vous brûler avec l’eau chaude présente sous le couvercle.
Sortez les petits pots avec une pince du type pince à cornichons.
Posez-les et laisser-les refroidir 3 heures.
Après ce temps, votre gélose s’est formée et devient compacte.



4 - Préparation de l'hypochlorite :

L’hypochlorite de calcium se présente en poudre (vous pouvez l’acheter sur le net chez les mêmes fournisseurs que les produits en fin de reportage).
Déposez l’hypochlorite dans un flacon avec un bouchon à vis (verrerie qui se commande très facilement).
Vous pouvez utiliser plus simplement les flacons comme ceux des sirops si pas la possibilité de commander des verreries à labo possibilité d’utiliser les flacons de sirops de médicament.
Versez l’hypochlorite puis 100 ml d’eau distillée dans le flacon, fermez correctement le bouchon puis laissez reposer le flacon pendant 1 mn pour dissoudre le plus possible la poudre d’hypochlorite. Remplissage des tubes a semis avec entonnoir et compresse pour filtrer l’hypochlorite
Avec un tube à semis avec un bouchon à vis, déposez les graines à l’intérieur puis disposez un petit entonnoir et une compresse stérile tissée pour permettre la filtration de l’hypochlorite contenue dans le flacon.
Quand votre hypochlorite est passée dans le tube à semis, ne le remplissez pas entièrement.
le flacon contient 100ml d’eau stérile on y verse l’hypochlorite en poudre dedans ! Quand cette poudre est bien dissoute on la passe dans un entonnoir avec une compresse stérile pour la faire passée dans les tubes qui renferme les semis. Note : ses explications ont étés donnés.
Afin de laisser un vide d’air d’un centimètre ou deux pour que le mélange eau/hypochlorite puisse bien se mélanger et ainsi évacuer assez facilement sans transporter les graines.
Vissez le bouchon du tube a semis et agitez-le pendant 1 minute afin que le paquet compact de graines se dissipe et que celles-ci soient au contact du désinfectant dans une suspension homogène.
Retournez le tube à semis (capsule tournée vers le bas) et laissez reposer exactement pendant 2 minutes.



Les graines remontent et forment un bouchon au dessus de la solution.
Dévissez le bouchon et laissez partir l’air doucement pour que sorte l’hypochlorite, les graines reste en haut et forme une masse collée sur les parois du tube.
Approchez la lampe à alcool et les petits pots (fermés pour le moment) à votre droite puis un petit récipient contenant un peu d’alcool à brûler où baigne la spatule à votre gauche.
Flambez l’encolure du tube à semis après l’avoir ouvert et avoir fait échapper le désinfectant pour que les graines puissent collés aux parois.
Avec la lampe à alcool, prenez la spatule et passez-la trois fois à la lampe à alcool puis laissez la refroidir.
Avec votre spatule stérilisée à la flamme, attrapez les graines qui se trouvent au fond des tubes à semis et déposez les graines délicatement sur la gélose.
Après avoir déposé les graines dans les petits pots, flambez l’encolure avec la lampe à alcool pour stériliser à nouveau puis avant de les fermer, passez aussi l’intérieur des couvercles au dessus de la flamme pour les stériliser.
Revissez le couvercle des petits pots, enrobez le dessus du pot avec du film étirable permettant une protection supplémentaire contre l’air entrant ainsi que les microbes et humidité.
Maintenant il faut attendre que les semis deviennent « le caviar vert » c'est-à-dire que les graines gonflent appeler « protocorme »
Il est possible avant de les repasser dans un nouveau milieu de REPIQUAGE (gélose) d’utiliser un scalpel stérile pour diviser les protocormes.
Après cette action vous préparez à nouveau un milieu repiquage dans les mêmes conditions de la première fonte.
Toujours dans un milieu le plus stérile !
Cette nouvelle gélose permet le développement de cal et de racines pour former des plantules d’orchidées.

La méthode est assez simple et devient très facile avec de l’expérience.



Sites de référence :
www.clivia.fr, site vente mallette de culture IN-VITRO complète.
La Maison Vacherot, site de vente d'orchidées, matériel culture IN-VITRO, etc.
www.orchidées-nature.com, vente orchidées, matériel culture IN-VITRO, etc.



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